GPC 원리
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GPC (gel permeation chromatography)는 고분자용액을 어떤 컬럼안(내부충진물이 가교된 gel)으로 투과 (permeation)시켜 고분자가 분자크기에 따라 분리될 수 있도록 고안된 분리법(chromatography)입니다.
쉽게 말하면, 분자량이 큰 물질이 먼저 유출되고, 작은 분자량물질이 느리게 나오는 원리를 적용하여, 고분자가 컬럼내부에서 얼마나 머무는가 하는 시간 (retention time)을 측정하면 각 시료의 고분자의 분자량을 산출할 수 있습니다. 고분자의 크기별로 분리한다고 해서 SEC (size exclusion chromatography) 라고도 부릅니다. 물질의 분자량을 측정할 수 있는 여러 가지 방법 (GC/Mass, LC/Mass, MALDI-TOF 등) 중, GPC는 고분자의 상대분자량을 측정할 수 있는 가장 일반적인 방법입니다.
일반적인 GPC System (일체형)
출처 : 토소社 EcoSEC SEC/GPC System brochure
일반적인 GPC System의 모식도
출처 : 토소社 EcoSEC SEC/GPC System brochure
GPC 기기 시스템은 일반 HPLC 시스템과 같이 pump, injector, column, detector, data system으로 구성되어 있습니다. 아래 표에 HPLC와 GPC의 차이점을 정리하였습니다. 가장 큰 특징은 분리원리가 HPLC는 극성차이를 이용하여 분리하는 것에 비하여, GPC는 크기별로 분리하는 GPC 컬럼이 내장되어 있습니다. 또한 일반적인 HPLC는 자외선(UV) 검출을 하는 것이 일반적인데, GPC의 경우 거의 굴절율(RI) 검출계를 사용하는 것이 일반적입니다. 굴절율은 온도에 아주 민감하여, GPC분석실의 실내온도는 항상 항온을 유지하여야 하며, 기기자체도 module형보다는 일체형의 기기가 굴절율 검출기의 안정화에 유리합니다. 굴절율 신호가 너무 작은 고분자의 경우는 ELSD (evaporative light scattering detector)를 사용하기도 합니다.
HPLC와 GPC의 차이점
| HPLC | GPC | |
| Separation Principle | Polarity | Size exclusion |
| Eluent | Water, methanol, acetonitrile 등 | Water, THF, DMF, CHCl3, TCB 등 |
| Column 충진물 | C18 silica beads | Porous polymeric beads |
| Detector | UV(mainly), RI, ELSD, MS | RI(mainly), UV, ELSD, LALS, MALS |
| 표준물질 | 농도를 아는 고순도물질 | 분자량을 알고 있는 PS, PMMA, PEG/PEO, 다당류 등. |
그럼 과연 어떻게 unknown 시료의 분자량을 알게 되는 것일까요? 이를 위해서는 이미 분자량을 알고 있는 몇 가지 표준물질(Standards)을 이용하여 보정(Calibration)을 해놓아야 합니다. 예를 들어 다른 분자량을 갖은 약 9개의 표준물질을 가지고 GPC를 해보면 아래와 같은 9개 피크를 가진 크로마토그램을 얻을 것입니다. 그리고 그 retention time vs molecular weight의 그래프를 그려보면 1차 혹은 2차 선형성을 갖게 되는 plot이 나옵니다. 이 plot을 검정곡선(calibration plot or calibration curve)이라고 부릅니다. 그리고, 우리가 분자량을 모르는 고분자의 GPC를 하였을 때, 그 calibration plot을 바탕으로 하여, 각 유출되는 시간대마다 나오는 물질의 분자량을 추정할 수 있게 되는 것입니다. GPC 표준물질은 분자량분포가 거의 없도록 특수하게 이온중합하여 제조된 고분자입니다. 주로 유기용매는 Polystyrene, PMMA가 사용되고 수용성의 경우 Polyethylene glycol, polysaccharide가 사용됩니다. GPC에 의한 분자량은 이 표준물질에 대한 상대분자량(Relative MW)이고, 절대분자량(Absolute MW)이나 참분자량(True MW)과는 다르다는 점을 꼭 기억해야 합니다.
표준물질 크로마토그램으로부터 얻어진 정량곡선
GPC결과 해석방법
아래 결과는 실제 PVC (polyvinyl chloride)를 GPC분석하여 나온 결과이고, Koptri가 제공하는 GPC결과의 사례입니다. 크로마토그램은 항상 retention time (유출시간) vs mV (검출강도)로 나타납니다. 먼저 분자량 162~1,074,000의 11개의 polystyrene 표준물질을 이용하여 11개 피크의 크로마토그램을 얻을 수 있습니다. 18분의 마이너스(음)의 피크는 시스템 피크라고도 하는데, 용매/시료중에 녹아있는 수분, 공기, 기포 등의 피크로 간주합니다. 이 크로마토그램으로부터 검정곡선을 작성하였고, 그리고 PVC시료의 GPC를 분석하여 가우시안 분포를 갖는 chromatogram을 얻었습니다. 그리고, 검정곡선에 대입하여 각 point마다 분자량을 계산하였고 최종적으로 수평균분자량 Mn 62,653, 중량평균분자량 Mw 135,728 의 결과를 얻을 수 있었습니다. Slice table은 GPC결과를 내기 위한 raw data table 로 생각하면 됩니다. 유기 저분자들은 단일분자량을 갖지만 고분자는 분자량분포를 갖기 때문에 평균분자량의 개념을 꼭 이해하여야 합니다. 자사 홈페이지의 “고분자의 평균분자량 개념”을 참고하시기 바랍니다.
폴리스티렌 표준물질의 크로마토그램
폴리스티렌 표준물질의 검량곡선
PVC(Poly(vinyl chloride))의 크로마토그램 및 분자량 분석결과
Poly(vinyl chloride)의 Slice Table
